除吸收铁（Fe）和锌（Zn）等元素以满足自身生长需求外，植物还会从土壤中获取诸如铜（Cu）、锰（Mn）、镍（Ni）、钴（Co）和镁（Mg）等金属元素。它们是植物行使各种生理生化功能所必须的元素，其摄入不足会造成营养缺乏性疾病［1］。其中Zn是许多蛋白质的关键辅助因子，在细胞生长、发育和分化等过程中均发挥重要作用［2-3］，充足的Zn有利于提高作物产量［4］；Cu是植物必需的微量元素，参与光合作用、呼吸作用、解毒和氧化还原等生理过程［5］；Mn参与组成植物光合蛋白和酶的主要结构，缺乏会导致光合系统II的损伤并阻断电子传递［6-7］。由此可见，适量的金属有益于植物体的生长发育，但其过量积累可对植物产生毒害作用。重金属含量的增加可以通过多种机制对细胞造成损害［8］，而且并未发现镉（Cd）、镓（Ga）、金（Au）、铅（Pb）、锂（Li）、汞（Hg）、银（Ag）、锡（Sn）和铀（U）等重金属在植物体中参与特定的生物功能，因此它们被认为是植物生存的非必需金属元素［9］。近年来，由于重金属向环境的排放日渐严重，在水稻等作物中检出了过量的Cd和砷（As）。其中，以Cd在植物中的富集尤为常见［10］，因为其通常会被Fe、Zn等金属的转运体转运并储藏在植物体内。因此，开展植物对重金属元素的吸收和运输机理研究，对于提高作物品质和减少可食用部位的重金属元素含量具有重要的理论和实际意义。
烟酰胺（Nicotianamine，NA）最初在烟草中发现的一种非蛋白氨基酸［11］，由三分子蛋氨酸经烟酰胺合成酶合成而来［12］。NA可作为金属螯合剂辅助亚铁离子（Fe2+），锰离子（Mn2+），锌离子（Zn2+）和铜离子（Cu2+）等金属离子在植物体内长距离运输［13-16］。此外，NA也是植物铁载体（Phytosiderophores，PS）合成的前体［17-18］。通过转基因技术提高水稻中NA和植物铁载体的浓度可增加胚乳中Zn和Fe含量，同时发现这些转基因株系中Cd的浓度降低，表明NA及PS的合成与分泌也可调节Cd在植物体内的储存［19］。NA外排转运体（EFFLUX TRANSPORTER of NA 1，ENA1）首次在卵母细胞中被发现具有转运NA的能力［20］。缺Fe会诱导ENA1基因在根中上调表达；在正常营养液培养下，OsENA1过表达转基因幼苗的根毛多于野生型，而在高浓度Zn营养液中根毛数目并无差异［21］。以上研究表明，ENA1可能对植物体内金属元素的稳态方面有一定的调节作用。在拟南芥（Arabidopsis）中发现了植物铁载体转运体（TRANSPORTER of MUGINEIC ACIDS 1，TOM1）的同源蛋白ZINCINDUCED FACILITATOR 1（ZIF1），其编码基因表达受Zn和Mn的诱导，并且ZIF1的突变体对Cd敏感［22］。此外，在过表达ZIF1的拟南芥植株中出现脉间黄化的表型，且转基因幼苗地上部分Zn的含量比野生型植株显著降低［22-23］。综上可见，影响NA的转运可能对各类金属元素的分布和储存产生不同影响。
ENA1作为NA的转运体在植物体内的金属元素的平衡方面有重要作用，但玉米的ENA1未见相关报道。我们前期研究发现，玉米（Zea mays.L）中的ZmENA1（Zm00001d0）与水稻（Oryza sativa.L）中的ENA1同源性最高，并且发现ZmENA1表达量对Fe的响应非常明显。因此，本研究克隆了玉米 ZmENA1的开放阅读框（ORF），分析了其蛋白序列特征，并通过荧光定量技术分析了ZmENA1在籽粒发育过程中的时空表达，以及在不同金属离子浓度下的表达模式，为深入研究ZmENA1通过应答植物自身发育与环境金属元素信号以调节NA分泌和金属离子转运和储藏的分子机理提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 本试验所用种子由中国农业科学院生物技术研究所保存。玉米B73自交系材料种植于中国农业科学院生物技术研究所试验田（河北省廊坊万庄）。玉米B73自交系幼苗材料置于28℃和光暗比16 h /8 h的培养箱中进行培养。
1.1.2 试验试剂 RNA 提取试剂盒、cDNA第一链的合成试剂盒以及 B 载体试剂盒均购自北京全式金生物公司；KOD高保真酶购自东洋纺公司；实时荧光定量 TB GreenTMPremix EX TaqTM购自 TaKaRa 公司；引物合成和测序工作由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；大肠杆菌感受态细胞 DH5α 购自北京擎科生物科技有限公司；Hoagland 营养液购自北京酷来搏科技有限公司；琼脂糖胶 DNA 回收试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司；大提质粒试剂盒购自 Promega 公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 取授粉后4 DAP和10 DAP 的玉米籽粒，此外分别取12 DAP、16 DAP、20 DAP、24 DAP、26 DAP和28 DAP玉米胚乳和种皮的混合部分以及胚。对于不同金属浓度下幼苗的处理，首先将玉米种子利用卷纸法在清水中进行萌发，待长到三叶期放入标准 Hoagland 营养液中培养至三叶一心期，随后进行金属处理：标准 Hoagland 营养液（对照），在标准Hoaglang营养液基础上将个别金属离子浓度分别配制为 c（Zn2+）：200 μmol/L、c（Mn2+）：500 μmol/L、c（Cu2+）：500 μmol/L、c（Cd2+）：500 μmol/L以及分别缺 Zn、Mn 和 Cu 的营养液，并取不同处理时间幼苗的地下部和地上部，液氮速冻存于-80℃。 上一篇：微波消解电感耦合等离子体质谱法同时测定环境 下一篇：没有了